二.     方法

1.   提取总RNA

1）     100mg标本剪碎后加500ul GIF变性液，在匀浆器内匀浆（若为抗凝血标本，可用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞后，直接加500ul GIF变性液），加入50ul 2MnaOAc、500ul水饱和酚，100ul氯仿，每步均需混匀。旋涡震荡器混匀10秒钟，冰浴5-15分钟。

2）     4℃10000g离心10分钟后，小心吸取上清移入新effendorf管中，切忌吸入蛋白，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h。

3）     4℃12000g离心10分钟后，弃上清；沉淀用100ulGIT变性液重溶，加入等体积乙丙醇混匀，-20℃1h。

4）     4℃12000g离心10分钟后，弃上清；用75%乙醇洗一遍。至此可加入1ml无水乙醇于-70℃保存备用，也可直接凉干，溶于适量无Rnase的去离子水中。

5）     用紫外分光光度计测出A260及A280的值，计算所提总RNA的含量。

2.   逆转录（RT）反应

于DEPC处理的0.5mlEppendorf管中，按表1加入所示试剂。

表1  逆转录（RT）反应体系

试剂名称                                    用量

总RNA                                  约1ug

MMLV                                        1ul

随机引物                                    2ul

逆转录反应体系                              7ul

去Rnase水                              补至20ul

快速离心混匀；37℃放置1h，95℃10分钟灭活MMLV。快速离心使蒸汽沉于管底。

3. PCR反应

在上述20ul RT产物0.5ml Eppendorf管中继续加入表2所示试剂。

表2 PCR反应体系

试剂名称                                    用量

RT反应产物                                 10-20ul

 PCR反应体系                                   19ul

 上游引物   P1                                  1ul

 下游引物   P2                                  1ul

 超净水                 补至100ul（含2ulTaqDNA聚合酶）

快速离心混匀， 95℃5分钟。离心使蒸汽沉于管底。加入2ul（1u/ul）Taq聚合酶，快速离心混匀，加入100ul液体石蜡。

循环条件：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟。循环35次，末次延长7分钟，电泳鉴定。

4. 定量分析

可用凝胶成像分析系统测出阳性标志物和β-actin的表达强度，按下表计算相对系数：

相对系数=标志物表达强度/β-actin表达强度

根据相对系数可作直方图或作统计学处理。

三.   注意事项

1. 提取总RNA应在严格的无Rnase环境下进行，避免RNA降解。

2. 应使用20ul以下移液器并配置相应的Tip加样，保证加样量的准确。

3. 应确保程序中所提的冰浴环境和4℃环境，保证反应温度的准确性。

注:  该中文说明书仅作参考!