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常见问题

ELISA实验常见问题分析

ELISA实验因灵敏度高,特异性强在生物科研上得到了广泛的认可,但对初学者而言,如不注意实验操作过程中的各个环节,可能会对最终的实验结果产生比较大的影响,比如实验出现白板,显色弱灵敏度低,花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。

1.白板现象
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中所有孔的颜色均为无色,即无信号呈现。
出现该现象的可能原因:
a.试剂已过保质期,不同批次稀释液交叉使用。
b.错加漏加检测A,检测B或者底物溶液TMB。
c.洗板或者加样过程中,酶标记物被污染失活,稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。
d.配置稀释液的蒸馏水可能被污染。
e.洗涤液是浓缩型的,没有按比例进行稀释。
f.酶标记物的活性和效价比较低。
g.溶液的PH值不正确,一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。
 
2.显色弱灵敏度低
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中孔的显色比较浅,即只有微弱的信号呈现。
出现该现象的可能原因:
a.产品过有效期,试剂没有按规定进行适当的保存。
b.试剂,标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。
c.少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。
d.洗板或者加样过程中,酶标物受污染失活。
e.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。
f.洗涤液稀释倍数不符合要求,洗板次数过多,洗板冲击力过大,洗板浸泡时间过长。
g.底物溶液TMB显色时间太短。
 
3.花板无梯度背景高
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后,酶标板中的孔有颜色但没有梯度,背景也可能较高.
出现该现象的可能原因:
a.底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存,实验前溶液已经变蓝。
b.孵育温度过高或者孵育时间过长,发生了较强的非特异性吸附。
c.没有按说明书要求洗板,特别是洗板时洗涤液的量少加了。
d.加样时没有换枪头造成交叉污染。
e.花板现象:低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体,封闭不足导致的本底不稳定,洗板不充分,包被板子的问题。

综上所述:在ELISA实验中应注意以下问题:
1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。
2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。
3.试剂保存:蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度,显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。
4.各试剂在使用前应充分混匀,以保证试剂的均一性和准确性。
5.严格控制反应温度和反应试剂。
6.洗板次数,洗板液的量,洗板液浸泡时间的长短,洗板的力度都是应该注意的问题。
7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用,PH值要保持在7.2-7.4之间。
8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。
9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。