如何确定 ELISA 实验中的稀释比 / 稀释因子

稀释比（Dilution Ratio）与稀释因子（Dilution Factor）是描述液体物质与其他溶剂混合后浓度变化的两个相关概念（但略有区别），常用于简单稀释操作--即将单位体积的目标液体与适当体积的溶剂混合，以达到所需浓度。稀释后的物质必须充分混匀，以实现真实的浓度稀释^[1]。
例如，1:4 的稀释比例表示 1 份溶质 + 4 份溶剂 = 5 份总体积，溶质与溶剂的体积之和即为最终总体积。

一、样本稀释的常规流程

1.1 实验前准备

在确定最终稀释比例前，需通过预实验评估样本中目标分析物的预期浓度范围，具体包括：
 
· 文献调研：查阅已发表的研究文献或试剂盒说明书，了解类似样本类型（如血清、细胞培养上清液）中目标分析物的典型浓度。
· 预实验：对未稀释样本及一系列稀释度（如 1:2、1:10、1:100）进行检测，以确定ELISA 试剂盒的线性检测范围^[2]。

1.2 标准曲线分析

ELISA 试剂盒通常提供由已知浓度目标分析物生成的标准曲线，其线性区间（通常为最大结合力的 20%~80%）定义了最佳检测范围。
 
· 目标：确保样本浓度落入该线性区间。
· 方法：
· 使用4PL或类似模型绘制标准曲线。
· 计算定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）。
· 对超过 ULOQ 的样本进行稀释，使其浓度落入线性范围^[3]。
（可联系：yuki@dldevelop.com.cn获得DLdevelop详细的ELISA数据分析指南）
 
1.3 制备系列稀释液
 
系列稀释是指使用相同稀释因子制备的一系列稀释液，常用于制备定量检测的标准浓度。通过相同稀释因子进行系列稀释，可使溶质浓度呈对数递减。这些标准浓度用于创建校准曲线，目标浓度或量可由此曲线计算得出。

二、计算稀释比例

在 ELISA 检测中，假设标准曲线的最高有效浓度为 C_max（如 200 pg/mL）。若某样本经 D 倍稀释后的检测值为 Csample_diluted，则样本实际浓度计算如下：
C_{sample_actual} = C_{sample_diluted} × D
为确保 C_{sample_diluted} ≤ C_max，稀释因子需满足：
D ≥ C_{sample_actual} / C_max (估算)
（若样本实际浓度未知，需通过预实验确定。）
示例：
若标准曲线的最高浓度为 200 pg/mL，某样本的估算浓度为 5000 pg/mL：
· 为留安全余量，常选择 50 倍稀释（确保 OD 值严格处于标准曲线的线性范围内）。

 三、通过重复实验和对照验证
重复实验：对每个稀释度进行三次重复检测，计算变异系数（CV）。(CV < 15%~20% 表明精密度可接受。)
加标回收率：向稀释样本中添加已知浓度的分析物，评估回收率（理想范围：80%~120%）。
平行性测试：确认稀释样本与标准曲线的斜率一致^[4]。

四、结论

确定 ELISA 稀释比或稀释因子需要进行实验前准备、标准曲线解析及严格验证。通过系统性评估样本类型、基质效应和试剂盒说明书，研究人员可优化检测的灵敏度和准确性。

参考文献

[1] Dr. Walker. Dilutions. Weber State University.
[2] Crowther, J. R. (2001). The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology. Humana Press.
[3] Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company.
[4] US Food and Drug Administration. (2018). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. FDA.gov.