超全的ELISA数据异常结果分析
一、基本原理
ELISA是一种利用酶标抗原（Antigen，Ag）或抗体（Antibody，Ab），在固相载体上定量或定性测定特异性抗体、可溶性抗原及细胞表面抗原的固相酶免疫测定技术。ELISA（酶联免疫吸附试验）结果的异常可能由多种因素引起，需结合实验设计、操作流程和样本特性进行系统分析。以下是常见的异常结果类型及可能原因。
二.常见数据异常结果及分析
1.整板无信号
| Standard |
Samples |
| 0.072 |
0.073 |
0.063 |
0.058 |
| 0.064 |
0.041 |
0.054 |
0.032 |
| 0.062 |
0.071 |
0.053 |
0.041 |
| 0.044 |
0.049 |
0.055 |
0.062 |
| 0.072 |
0.053 |
0.063 |
0.048 |
| 0.064 |
0.059 |
0.057 |
0.072 |
| 0.052 |
0.070 |
0.053 |
0.071 |
| 0.074 |
0.061 |
0.066 |
0.067 |
| 可能原因 |
| 1.试剂盒未按说明书存放温度保存; |
| 2.未在剂盒有效期内使用，试剂溶解后保存超过说明书要求的时长; |
| 3.试剂加入顺序有误:生物素化抗体与酶结合物加入顺序不正确; |
| 4.试剂存在混用的情况:与其它厂家试剂或其它指标试剂混用; |
| 5.操作相关问题:实验前未试剂盒平衡;标准品未溶解完全等. |
2.标曲线性差，跳孔
| Standard |
| 2.590 |
2.598 |
| 1.560 |
1.619 |
| 1.232 |
1.240 |
| 0.611 |
0.581 |
| 0.661 |
0.618 |
| 0.197 |
0.183 |
| 0.150 |
0.155 |
| 0.089 |
0.086 |
| 可能原因 |
相应对策 |
| 1.吸液或加液不准确 |
检查移液器及吸头 |
| 2.标准品稀释不正确，未充分混匀 |
每一步倍比稀释过程均需充分混匀，使粉末完全溶解（吹打20次左右） |
| 3.洗涤不完全 |
保证洗涤时间和洗涤次数及每孔加样量 |
| 4.孔间交叉污染 |
弃液时动作迅速；拍板更换吸水纸 |
| 5.孵育仪器不正确 |
采用37℃恒温箱孵育 |
| 6.上样时存在较大气泡 |
混匀时动作轻柔，减少大气泡的产生 |
3.标曲整体偏低
| Standard |
| 0.585 |
0.706 |
| 0.341 |
0.307 |
| 0.219 |
0.226 |
| 0.112 |
0.122 |
| 0.082 |
0.091 |
| 0.078 |
0.066 |
| 0.071 |
0.062 |
| 0.054 |
0.073 |
| 可能原因 |
相应对策 |
| 1.试剂盒保存不当 |
严格按照试剂盒说明书存放 |
| 2.试剂在使用之前未平衡至室温 |
实验前将试剂盒室温放置 20min 左右 |
| 3.温育时间/温度未达到要求 |
采用 37℃恒温箱孵育 |
| 4.底物作用时间较短，显色不足 |
可延长显色时间，一般不超过 25min |
| 5.工作液配置时间较久 |
使用前 15min 左右配置 |
| 6.工作液稀释比例不正确 |
需将 100×工作液配置成1×工作液 |
| 7.试剂体积不够或漏加 |
检查洗液或加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加 |
4.标曲，样本全阳
| Standard |
Samples |
| 2.527 |
2.706 |
3.527 |
3.706 |
| 2.341 |
2.307 |
3.341 |
3.307 |
| 2.211 |
2.226 |
3.211 |
3.226 |
| 2.112 |
2.122 |
3.112 |
3.122 |
| 1.827 |
1.791 |
2.827 |
2.791 |
| 2.075 |
2.066 |
3.075 |
3.066 |
| 2.607 |
2.652 |
3.607 |
3.662 |
| 2.453 |
2.773 |
3 .459 |
3.863 |
| 可能原因 |
| 1. 孔间交叉污染:样本测值较高，洗板时污染到了标准品; |
| 2. 倍比稀释未充分混匀:每步稀释过程建议用移液枪吹打20次左右再上样; |
| 3. 洗涤液污染:洗液重复使用或配置容器污染 |
5.标曲背景孔偏高
| Standard |
| 2.442 |
2.439 |
| 1.801 |
1.799 |
| 1.165 |
1.164 |
| 0.639 |
0.641 |
| 0.411 |
0.409 |
| 0.347 |
0.341 |
| 0.258 |
0.275 |
| 0.184 |
0.202 |
| 可能原因 |
| 1. 洗板问题，洗板操作(洗涤时间、洗板次数等是否按说明书进行); |
| 2. 板条存放是否得当:温度较高环境存放本底有可能会升高，比如操作完后没有及时将剩余的板条密封入"自封袋，置于外界环境时间过长; |
| 3. 板孔底部是否有脏污; |
| 4. 加入的 HRP 酶结合物是否过量,孵育时间和温度是否超过说明书的规定; |
| 5. 洗液的配制，洗液有污染; |
| 6. 孔自孔加液时未更换枪头 |
6.变异系数大
| Standard |
Samples |
| 2.458 |
2.306 |
0.765 |
0.423 |
| 1.566 |
1 327 |
0.341 |
0.307 |
| 0.953 |
0.945 |
0.211 |
0.426 |
| 0.46 |
0.852 |
0.412 |
0.422 |
| 0.277 |
0.264 |
0.827 |
0.791 |
| 0.168 |
0.174 |
0.675 |
0.366 |
| 0.12 |
0.137 |
0.607 |
0.662 |
| 0.046 |
0.053 |
0.453 |
0.473 |
| 可能原因 |
| 1. 加样时间较长:上样时间建议控制在10 min之内; |
| 2. 取液不准确:检查移液器及枪头挂壁等情况; |
| 3. 未使用推荐孵育仪器:采用 37℃恒温箱孵育; |
| 4. 有大气泡产生导致反应不完全 |
| 5. 孔间交叉污染。 |
7.样本无信号
| 可能原因 |
| 1. 样本放置时间较久，蛋白降解; |
| 2. 样本本身浓度较低，试剂盒灵敏度较低不能满足其检测需求(尤其是细胞因子); |
| 3. 未使用推荐孵育仪器:建议采用 37℃恒温箱孵育; |
| 4. 有大气泡产生导致反应不完全; |
| 5. 孔间交叉污染。 |
