ELISA实验中血液样本采集和处理方法

一、血液样本类型与选择
血液样本主要分为全血、血清和血浆。血清是血液自然凝固后分离出的淡黄色液体，不含纤维蛋白原和凝血因子；血浆则是全血加入抗凝剂后离心得到的液体，保留了凝血因子和抗凝剂成分。ELISA 实验中，血清和血浆是最常用的样本类型：
血清：适用于大多数免疫指标检测（如抗体、细胞因子），但凝血过程可能导致部分蛋白吸附或降解，且制备时间较长（需 1-2 小时自然凝固）。
血浆：适用于凝血功能检测或需快速处理的样本，常用抗凝剂包括 EDTA（抑制金属离子依赖的酶活性）、肝素（抑制凝血酶形成）和枸橼酸钠（螯合钙离子）。需注意，EDTA 可能干扰某些生化指标（如 Mg²⁺、K⁺），而肝素可能影响 RNA 实验。
血清和血浆样本的主要区别在于血浆中抗凝剂和凝血因子的影响。
多数指标中血浆样本可以替代血清，前提是该指标不受抗凝剂成分和凝血因子的影响（如抗体类项目），但生化指标则不可用EDTA抗凝分离血浆，因为EDTA-K2此种抗凝剂不仅可以络合重金属Mg2+，也会致使K+的含量上升，故生化指标的最佳样本是血清。一般全血能收集到30-50%左右的血清/血浆。
血红蛋白类指标需采用溶血剂破碎血细胞后来进行测定，凝血因子类指标需使用血浆，其他部分指标血清血浆中有较大差异，血清血浆样本类型的选取，建议多参考国内外文献，选择合适的样本类型。
二、血液样本采集方法
采集前准备
使用无热原、无内毒素的真空采血管或离心管，根据检测需求选择抗凝剂类型（如红色头盖管用于血清，紫色头盖管含 EDTA 用于血浆）。
患者需空腹或按医嘱准备，避免剧烈运动或饮酒，以减少血液成分波动。
静脉采血操作
消毒穿刺部位后，使用真空采血管采集静脉血，避免溶血（如止血带压迫时间过长、穿刺不顺利）。
全血采集后需轻柔颠倒混匀抗凝管（如 EDTA 管颠倒 5-8 次），避免剧烈振荡导致血细胞破裂。
动物采血方法
小鼠：常用剪尾取血（消毒后剪断尾尖，用棉球收集血液）或眼球后静脉丛取血（使用肝素化玻璃毛细管刺入眼眶静脉丛）。
大鼠：可采用心脏穿刺或颈动静脉取血，需注意麻醉深度和无菌操作。
三、血液样本处理流程
血清制备
全血室温静置 1-2 小时或 4℃过夜，待血液完全凝固后，1000×g 离心 20 分钟，取上清液分装保存。
若需快速分离血清，可使用含促凝剂的采血管（如金黄头盖管），离心前无需长时间静置。
血浆制备
抗凝全血需在 30 分钟内离心（2-8℃，1000×g，15 分钟），避免凝血因子降解。
分离后的血浆需立即分装，避免反复冻融（如 - 80℃保存不超过 2 个月）。
 
动物采血管少量采血，建议采用无菌无毒素的离心管收集，自然凝集后离心分离血清；或抗凝离心管（肝素/EDTA分离血浆），轻轻颠倒混匀后离心分离血浆。
样本储存与运输
短期保存（1 周内）可置于 4℃，长期保存需分装后 - 80℃冻存，避免反复冻融导致蛋白变性。
运输时需使用干冰维持低温，确保样本稳定性。
四、关键注意事项
避免溶血
溶血会释放血红蛋白，其过氧化物酶活性可能导致 ELISA 非特异性显色（假阳性）。采血时应避免穿刺不顺利、离心速度过高或样本反复冻融。
抗凝剂选择
不同抗凝剂对检测结果有显著影响。例如，EDTA 会干扰金属离子依赖的酶活性，而肝素可能与某些抗体结合。需根据试剂盒说明书选择抗凝剂，并进行预实验验证。
细菌污染
细菌分泌的酶可能降解目标蛋白，或产生内源性 HRP（辣根过氧化物酶）干扰显色反应。采血时需严格无菌操作，样本离心后若出现混浊需再次离心。
样本稳定性
某些指标（如细胞因子）在室温下易降解，需在采血后 1-2 小时内完成离心和分装。储存时间过长可能导致结果偏差，建议 - 80℃保存不超过 6 个月。
 
五、常见问题与解决方案

问题	原因	解决方案
溶血	穿刺不顺利、离心速度过高	优化采血技术，控制离心条件（<1500×g）
样本凝固	抗凝剂不足或混匀不充分	按比例添加抗凝剂，轻柔颠倒混匀
结果异常偏高	溶血或细菌污染	重新采集样本，严格无菌操作
结果波动较大	样本反复冻融或储存不当	分装保存，避免反复冻融

 
参考文献
CLSI. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing; Approved Standard—Fifth Edition. CLSI document H21-A5. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017.
Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
Lechmann J, et al. Fully automated dried blood spot sample handling and extraction for BoHV-1 antibody testing by ELISA. J Virol Methods. 2022;308:114626. doi:10.1016/j.jviromet.2022.114626.
孙立平。两种抗凝剂对血液4项指标ELISA检测结果干扰的分析[J]. 中国输血杂志，2006, 19 (4):290-292.